تازه های سایت
خانه / GENETICS / تکنیک های آزمایشگاهی ژنتیک

تکنیک های آزمایشگاهی ژنتیک

استخراج اسیدهای نوکلیئک

نخستین گام در بررسی مولکولی ساختار ژنتیک سلول ها دسترسی به ماده ژنتیک می باشد. اصول استخراج ماده ژنتیک از سلول های مختلف (باکتری ها، سلول های گیاهی و سلول های جانوری) نسبتا یکسان است و تنها در برخی از جزئیات تفاوت هائی وجود دارد. استخراج اسید های نوکلئیک شامل دو مرحله تهیه عصاره سلولی و خالص سازی می باشد.

 

تهیه عصاره سلولی

برای تهیه عصاره سلولی به تعداد زیادی سلول نیاز است. عموما سلول ها با تکثیر در محیط کشت و یا مستقیما از بافت ها (مانند بافت خون) تأمین می شوند. سپس باید دیواره و غشاء سلول ها از بین بروند تا محتویات آنها آزاد شوند. برای تخریب دیواره یا غشاء سلولی، روش های فیزیکی و شیمیایی مختلفی بکار می رود. از روش های فیزیکی می توان به شوک اسمزی، سائیدن سلول های یخ زده و استفاده از امواج صوتی یا سونیکیشن اشاره کرد. در سونیکیشن، طول موج و شدت امواج صوتی به کار گرفته شده به نوع سلول و کاربردی که از عصاره سلول مورد نظر است، بستگی دارد. در روش های شیمیایی از آنزیم ها و موادی که باعث تخریب دیواره و غشاء می شوند استفاده می شود. برای مثال، برای شکستن دیواره باکتری ها از آنزیم لیزوزیم یا اتیلن دی آمین تتراستات (EDTA) یا مخلوطی از آنها استفاده می شود. لیزوزیم با عمل آنزیمی خود باعث تجزیه پپتیدو گلیکان دیواره سلولی می شود و EDTA با حذف یون های فلزی مانند Ca2+ و Mg2+ که در استحکام دیواره نقش دارند، دیواره را سست می کند. به علاوه EDTA با حذف یون های فلزی که به عنوان گروه پروتستتیک در آنزیم های تجزیه کننده اسیدهای نوکلئیک عمل می کند، مانع تجزیه این مواد می شود.

در سلول های جانوری بعلت فقدان دیواره سلولی، با یک شوک اسمزی ساده می توان غشاء سلول ها را شکست. با این حال اغلب از موادی مانند سدیم دود سیل سولفات (SDS)، دو دسیل سارکوزین و تریتون X100 که غشا را در خود حل می کنند، استفاده می شود. SDS همچنین باعث پایداری اسیدهای نوکلئیک می شود. مراحل تهیه عصاره سلولی باید در محلول های محافظت کننده اسیدهای نوکلئیک که معمولا حاوی بافر تریس هیدروکلرید، SDS و EDTA است انجام شود تا کمترین آسیب به ماده ژنتیک برسد.

برای استخراج ماده ژنتیک سلول های انسانی، معمولا از سلول های سفید خون که یک تا سه ساعت مانده اند یا خون منجمد، سلول های کشت یافته مانند کشت فیبروبلاست ها، کشت سلول های پرزهای جنینی (CVS) یا کشت سلول های مایع آمنیوتیک استفاده می شود.

 

خالص سازی DNA

برای خالص سازی DNA برحسب نوع سلول و کاربرد مورد نظر، روش های مختلفی ابداع شده است. روش های مزبور از اصول یکسانی تبعیت می کنند که شامل رسوب دادن مرحله به مرحله ناخالصی ها و استخراج DNA خالص می باشد. در این روش ها ابتدا با کمک مواد واسرشت کننده پروتئین ها نظیر فنل، این مواد از عصاره سلولی حذف می شوند. سپس DNA در فاز قطبی (آبی) بصورت محلول استخراج می شود. اگر مقدار پروتئین ها زیاد باشد می توان قبل از مرحله فوق پروتئین ها را با آنزیم های تجزیه کننده مانند پروتئیناز k تجزیه و حذف نمود.

پس از جدا کردن فاز آبی، می توان با اضافه کردن الکل هائی نظیر اناتول یا ایزو پروپانول در حضور کاتیون Na+ یا آمونیوم، اسیدهای نوکلئیک را رسوب داد. در سلول های گیاهی و سلول های بافت کبد که مقدار هیدرات های کربن زیاد است برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک از CTAB و محلول نمک استفاده می شود. این محلول فقط باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک می شود و پلی ساکاریدها بصورت محلول باقی می مانند. رسوبی که به روش های فوق بدست می آید حاول مخلوطی از RNA و DNA است. برای خالص سازی DNA می توان با اضافه کردن ریبونوکلئاز، RNA را هیدرولیز کرده و DNA خالص بدست آورد.

امروزه شرکت های مختلف تهیه کننده مواد بیولوژی مولکولی اقدام به تهیه کیت هایی برای استخراج اسید های نوکلئیک از منابع مختلف سلولی نموده اند که در صورت عدم وجود محدودیت مالی در آزمایشگاه می توان با استفاده از کیت های مزبور در مدت زمان کم و با بازده نسبتا بالائی اقدام به تهیه اسید های نوکلئیک با درجه خلوص بالا نمود. به علاوه سیستم های روبوتیک مختلفی اختراع شده اند که روزانه قادر به استخراج هزاران نمونه از اسید های نوکلئیک از نمونه های مختلف میکروبی، گیاهی و حیوانی می باشند.

 

روش های الکتروفورز در بیولوژی مولکولی

پس از استخراج ماده ژنتیک، مرحله بعدی تفکیک آن به قطعات تشکیل دهنده و شناسایی هر قطعه می باشد. همچنین در هنگام بررسی پروتئین های سلولی نیز نیاز به تفکیک انواع پروتئین ها از هم می باشد. به سبب اینکه ماکرو مولکول های زیستی باردار هستند، می توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می شود. روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است که در زیر به معرفی انواع متداول آن می پردازیم:

۱- الکتروفورز سطحی: از یک نوار کاغذی یا استات سلولزی بعنوان فاز ثابت استفاده می شود. دو روش فوق جز در برخی کارهای پژوهشی کاربرد چندانی ندارند.

۲- الکتروفورز ژل: از یک محیط نیمه جامد (ژل) بعنوان فاز ثابت استفاده می شود. این نوع الکتروفورز بر حسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می شود.

به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئینها دارای بار مختلف هستند، معمولا برای اینکه تفکیک فقط بر اساس وزن مولکولی انجام شود، به بافر ماده شیمیائی، SDS سدیم دو دسیل سولفات اضافه می شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می شود که باعث القاء بار منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد، قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می نماید.

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریع تر و آسان تر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ دی ای آ (بزرگتر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد، استفاده از ژل آگاروز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته ای و قطعات DNA تک رشته ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳% و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگاروز ۸/. درصد استفاده می شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل همزمان با الکتروفورز استفاده می شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می شود. در این ژل ها مولکول های کوچکتر در مقایسه با مولکول های بزرگتر سریع تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می کنند. از روش PAGE برای بررسی موتاسیون ها و تعیین توالی DNA استفاده می شود.

۳- الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار: چنانچه اشاره شد، هر چه غلظت ژل کمتر باشد با آن می توان مولکول های بزرگتری را بوسیله الکتروفورز، تفکیک کرد. ولی در این رقت محدودیت وجود دارد به طوریکه حتی با رقیق ترین ژل های آگاروز هم نمی توان مولکول های DNA بزرگتر از ۱۰۰ کیلو جفت باز را تفکیک کرد. برای این منظور از روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار استفاده می شودکه دارای انواع مختلفی است:

الف: الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی (UPFGE): یکی از ساده ترین روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار، روش UPFGE می باشد. برای این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود. در UPFGE، میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و دوباره برقرار می شود. هنگامی که میدان برقرار است مولکول DNA بصورت گسترده در آمده و در جهت میدان حرکت می کند. با قطع شدن جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و DNA فرصت می یابد تا به حالت هیئت فضایی خاص خود در آید، ولی با برقراری مجدد جریان، حرکت مولکول آغاز می شود. در زمانی که میدان الکتریکی برقرار نیست، همه مولکول ها فرصت نمی کنند بطور کامل به شکل فضایی خود در آیند. هر چه مولکول کوچک تر باشد، سریع تر می تواند به شکل فضایی خود در آید و از آن خارج شود. براین اساس می توان مولکولهای نسبتا بزرگ را از هم تفکیک کرد. با استفاده UPFGE می توان مولکولهایی تا اندازه ۴۰۰ کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. از این روش الکتروفورزی در آنالیز ژن های بزرک نظیر ژن کد کننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، استفاده می شود.

ب: الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE): در روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین، معکوس می شود. در این روش برای تفکیک مولکول های کوچک از دامنه های زمانی کم استفاده می شود، یعنی میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت ۵/. ثانیه در جهت مستقیم و به مدت ۲۵/. ثانیه در جهت مخالف برقرار می شود. در مورد مولکول های بزرگتر از زمان های بیشتر، ۳ ثانیه به جلو و ۱ ثانیه در جهت مخالف استفاده می شود. با این روش می توان مولکول هایی تا اندازه ۸۰۰ کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد.

ج: ژل اکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار (PFGE): این روش یکی از متداول ترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار است. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت بهم بصورت عمود قرار گرفته اند، در فواصل زمانی معین بطور متناوب استفاده می شود. یکی از این میدان ها در جهت بالا به پائین و دیگری در جهت چپ به راست قرار دارد. مولکول های DNA پس از آنکه تحت تأثیر میدان اول حرکت کردند، در اثر میدان دوم، ۹۰ درجه تغییر جهت داده و حرکت می کنند. در اثر این روش مولکول های DNA با یک حرکت چرخشی خود، در طول ژل بصورت زیگ زاگ حرکت می کنند. در روش PFGE می توان مولکول های بسیار بزرگی در اندازه بین ۲۰ هزار تا ۲ میلیون جفت باز را از هم تفکیک کرد.

 

روش های مختلف رنگ آمیزی گسترش های خونی

در آزمایشگاه های بیولوژی سلولی که هدف فقط مشاهده گلبول های سفید می باشد، با هر رنگی که بتواند هسته یا میتوکندری را رنگ کند، مانند سبز ژانوس و لازارو، می توان گلبول های سفید را رنگ آمیزی کرد.

اما در آزماشگاه های هماتولوژی که هدف شناسایی ناهنجاری های گلبول های سفید (مانند شناسایی سلول های لوکمیایی) است معمولا بصورت استاندار از روش های زیر استفاده می شود:

۱- روش های گیمسا Giemsa

2- روش رایت Wright Stain

3- رنگ آمیزی با برلیان کرزیل بلو Brilliant Cresyl Blue

4- رنگ آمیزی با Aniline blue

5- روش Papanicolaou (برای اطلاعات بیشتر در مورد این روش، به روش پاپا نیکولائو مراجعه کنید.)

۶- استفاده از محلول ائوزین متیلن بلو می گران والد، May-Grünwald´s eosin methylene blue solution

7- روش های آنزیمی: در این روش ها، گلبول های سفید بعلت حضور حضور آنزیم های خاصی در آنها شناسایی می شوند.

بر خی از این آنزیم ها عبارتند از:

الف: آنزیم پراکسیداز در گرانولوسیت ها

ب: آنزِیم آلکالین فسفاتاز

ج: آنزیم نفتیل استات استراز

تکنیک های آزمایشگاهی ژنتیک

تکنیک های آزمایشگاهی ژنتیک

انتشار توسط 8 تم

درباره‌ی genetical

این سایت جهت بالا بردن سطح علم در جامعه ایران می باشد و برای راحتی و گرد هم آوردن مطالب علمی و پزشکی در یک مکان مجازی که شامل آزمایشگاه ها ، دانلود کتاب ، کنکور , مطالب علمی ژنتیک - بیوشیمی - میکروبیولوژی می باشد . و با به روز رسانی هر روز این سایت مفتخریم که برترین سایت پزشکی ایران شویم .

جوابی بنویسید

ایمیل شما نشر نخواهد شدخانه های ضروری نشانه گذاری شده است. *

*


2 + دو =

شما می‌توانید از این دستورات HTML استفاده کنید: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>