تازه های سایت
خانه / GENETICS / روش انجام Pcr

روش انجام Pcr

9

(PCR) و مکانیسم آن به زبان ساده

 چکیده

یکی از مهمترین پیشرفت ها در دو دههء اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی بویژه در کاربردهای تشخیصی، واکنش زنجیرهء پلیمراز (PCR) Polymerase Chain Reaction می باشد، که علاوه بر افزایش سرعت آزمونهای وابسته بهDNA ، در اکثر موارد موجب افزایش حساسیت اینگونه آزمایش ها گردیده است. PCR به یک روش ازدیاد مقادیر جزیی DNA (یا RNA) تا حد مشاهده آنها توسط روشهای ساده و رایج آزمایشگاهی اطلاق می گردد.

هر چرخه PCR شامل سه مرحله می باشد:

1-مرحله تقلیب یا تغییر ماهیت

(Denaturation Step) :

در این مرحله مولکولهای دو رشته ای DNA بوسیله حرارت بالا (حدود 94 درجه سانتیگراد) از همدیگر جدا گردیده و به مولکولهای تک رشته ای تبدیل می شوند.

2-مرحله پیوند زنی

(Annealing or Hybridization Step) :

در این مرحله کاهش دمای واکنش صورت می گیرد تا اینکه پرایمرها بتوانند به مولکولهای DNA تک رشته ای پیوند زده شوند. درجه حرارت مورد استفاده برای این مرحله می تواند از 30 درجه سانتیگراد تا 72 درجه سانتیگراد متغیر باشد.

3-مرحله توسعه (Extension Step) :

در این مرحله آنزیم Taq پلیمراز (DNA پلیمراز) پرایمرها را در روی DNA تک رشته ای امتداد می دهد تا DNA دو رشته ای جدید بسازد. درجه حرارت لازم برای این مرحله 72 درجه سانتیگراد می باشد.

مقدمه:

پیشرفت های دو دههء اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی موجب ارتقاء کارآیی و تکامل هر چه بیشتر آزمایش های وابسته به DNA در علوم بالینی گردیده است. استفاده از مارکرهای غیر رادیواکتیو و اولیگونوکلئوتیدهای مکمل با ژن ها و یا مترادف های ویژه بازهای آلی در DNA از جمله پیشرفت های مؤثر در بهبود و بکارگیری روزافزون تست های وابسته به DNA در طیف تشخیص بالینی محسوب می شود. یکی از مهمترین پیشرفت ها در زمینه بیولوژی مولکولی که در عین حال کاربرد تشخیصی نیز دارد (PCR) Polymerase Chain Reaction می باشد که علاوه بر سریع نمودن آزمایش های وابسته به DNA در موارد متعدد موجب افزایش حساسیت اینگونه آزمایش ها گردیده است.

با توجه به پیشرفت روزافزون علوم پزشکی در جهان امروز و استفاده وسیع از PCR بعنوان یک روش حساس، سریع و دقیق تشخیصی در آزمایشگاههای بالینی، در این گفتار سعی شده است تا PCR و مکانیسم آن به زبانی ساده و بطور اجمالی بیان شود تا پزشکان و متخصصینی که در عرصه های آزمایشگاهی از نزدیک با این تکنیک بسیار مفید کار نکرده اند با چگونگی عملکرد آن آشنایی پیدا کنند. ذکر این نکته ضروری است که راه اندازی این روش و یا روش های مشابه در زمینه بیولوژی مولکولی و بهره وری از آنها در مراکز آزمایشگاهی و تحقیقاتی، منجر به حصول نتایج چشمگیر و سودمند در زمینه تشخیص آزمایشگاهی و همچنین مطالعات اپیدمیولوژیک خواهد شد.

تعریف PCR:

به طور کلی Polymerase Chain Reaction (PCR) به روش ازدیاد مقادیر جزیی DNA یا RNA (ازدیاد RNA با روش RT-PCR امکان پذیر است) تا حد مشاهدهء آنها توسط روش های ساده و رایج آزمایشگاهی اطلاق می شود. قابلیت PCR در ازدیاد اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه مورد آزمایش موجب شناسایی سریع و اختصاصی نوع سلول یا میکروارگانیسم مورد نظر در نمونه مذکور می گردد که این ویژگی علاوه بر بکارگیری PCR در تشخیص آزمایشگاهی بیماریها شناسایی انواع سلولها، آنرا به عنوان ابزاری مطمئن و حساس در زمینه پژوهش های علمی مطرح می سازد.

از زمان معرفی PCR در سال 1985، بکارگیری آن در تحقیقات بیولوژیکی پایه و کاربردی موجب ایجاد تغییرات اساسی گردیده است. PCR یکی از جدیدترین تکنولوژی های آزمایشگاهی است که در تشخیص بیماریهای عفونی، پزشکی قانونی و ناهنجاریهای ژنتیکی مورد استفاده و توجه قرار گرفته است. در خصوص کارآیی این روش در تشخیص به عنوان مثال می توان تقلیل مدت زمان تشخیص آزمایشگاهی اختصاصی باسیل سل در نمونه های کلینیکی را از 7-6 هفته به 7-6 ساعت حتی با وجود تعداد اندک باسیل در نمونهء آزمایشگاهی ذکر کرد. از نکات جالب توجه دیگر اینکه با استفاده از تکنیک حساس PCR ، DNA میکروارگانیسم هایی نظیر باسیل جذام و باسیل سل از نمونه های باستانی با قدمت بیش از 1000 سال شناسایی و جدا گردیده است که نتایج حاصله گامی مهم در راه شناخت و مطالعه بیش از پیش تاریخچه علم پزشکی بوده ضمن آنکه این موفقیت توانسته است راهگشای ایجاد شاخه های دیگری از علوم نظیر پالئوباکتریولوژی باشد.

 مکانیسم PCR:

همانطوریکه می دانیم DNA، یک مولکول مارپیچی دو رشته ای پلی نوکلئوتیدی است که این دو رشته در جهت مقابل هم قرار گرفته اند و بطور ویژه ای بوسیلهء پیوندهای هیدروژنی میان بازهای آلی مکمل بیکدیگر متصل هستند (سیتوزین بوسیله سه پیوند هیدروژنی به گوانین و آدنین بوسیله دو پیوند هیدروژنی به تیمین اتصال پیدا می کند). DNA دورشته ای می تواند بوسیله حرارت از هم جدا شده و دو مولکول DNA تک رشته ای ایجاد کند که این مرحله بنام مرحلهء تغییر ماهیت (تقلیب) شناخته می شود. مولکولهای DNA تک رشته ای از طریق واکنش های متقابل ویژه بین بازهای مکمل به همدیگر متصل شده که حاصل آن ایجاد و آغاز مرحله ای بنام مرحله پیوندزنی annealing) و یا (hybridization می باشد. دو مرحلهء فوق الذکر برای Probe technology و همچنین PCR بکار می رود. مرحله بعدی یا سوم که برای PCR بوده و این روش را از سایر تکنیک های مولکولی متمایز می سازد مرحله توسعه (extension) می باشد که طی آن یک قطعه DNA تک رشته ای بوسیله DNA پلیمراز توسعه پیدا می کند. در این مرحله یک قطعه DNA تک رشته ای کوتاه (primer) به یک مولکول DNA تک رشته ای طویل تر پیوند زده شده و DNA پلیمراز Taq) پلیمراز) قادر می شود به انتهای ¢3 مولکول کوتاهتر یا پرایمر متصل گردیده و با استفاده از داُکسی نوکلئوتید تری فسفات ها آنرا امتداد داده و قطعه ای سنتز نماید که آن قطعه مکمل DNA تک رشته ای طویل تر باشد و بدین ترتیب DNA دو رشته ای جدید ساخته می شود .

مولکولهای DNA تک رشته ای کوتاه (اولیگونوکلئوتیدها) بوسیله تکنیک های شیمیایی به صورت سریع و ارزان ساخته می شوند. اولیگونوکلئوتیدها وقتی که به DNA تغییر ماهیت داده (تقلیب شده) افزوده می شوند، به عنوان پرایمر برای DNA پلیمراز عمل نموده و اجازه می دهند تا DNA جدید در داخل آزمایشگاه سنتز شود. بنا به دلیل فوق الذکر اولیگونوکلئوتیدها را پرایمر (primer) می نامند. در PCR دو نوع پرایمر مورد استفاده قرار می گیرد که هر کدام از آنها به محل های ویژه در دو رشتهء مکمل مولکول DNA هدف پیوند می شوند  پرایمرهای مذکور به صورتی ساخته شده اند که زمانیکه DNA پلیمراز یک پرایمر را توسعه می دهد، یک مولکول DNA بوجود می آورد که آن DNA دارای یک محل اتصال جدید برای پرایمر دیگر می شود. این رشتهء DNA جدید تولید شده نیز همینطور قادر خواهد بود به عنوان الگو (template) برای سنتز DNA از پرایمر دیگر در جریان چرخه های بعدی PCR، عمل نماید.

بنابراین تا اینجا معلوم می شود که هر چرخهء PCR شامل سه مرحله می باشد .

1- مرحله تقلیب یا تغییر ماهیت(Denaturation Step):

 

در این مرحله مولکولهای دو رشته ای DNA بوسیلهء حرارت بالا (حدود 94 درجه سانتیگراد) از همدیگر جدا گردیده و به مولکولهای تک رشته ای تبدیل می شوند.2- مرحله پیوند زنی

(Annealing or Hybridization Step)

در این مرحله کاهش دمای واکنش صورت می گیرد تا اینکه پرایمرها بتوانند به مولکولهای DNA تک رشته ای پیوند زده شوند. درجه حرارت مورد استفاده برای این مرحله می تواند از 30 درجه سانتیگراد تا 72 درجه سانتیگراد متغیر باشد.

 

 2-مرحله توسعه (Extension Step):

 

در این مرحله که آخرین مرحلهء یک چرخهء PCR می باشد، آنزیمTaq پلیمراز (که DNA پلیمرازی است مقاوم به حرارت و از یک باکتری ترموفیل بنام ترموس آکواتیکوس Thermus aquaticus استخراج می شود) با استفاده از داُکسی نوکلئوتید تری فسفاتها، پرایمر را در روی DNA تک رشته ای امتداد می دهد تا DNA دو رشته ای جدید بسازد  درجه حرارت لازم برای این مرحله72 درجه سانتیگراد می‌باشد که این درجه حرارت برای آنزیم های مقاوم به حرارتی که به طور عادی مورد استفاده قرار می گیرند مناسب می باشد.

 3-

هر چرخهء PCR نهایتاً با دو برابر شدن تعداد ترادف های DNA هدف همراه است که تکرار چرخه بدفعات زیاد (20 تا 50 بار) منجر به افزایش توانی در تعداد ترادف های DNA هدف و در نتیجه ازدیاد DNA هدف به میزان یک میلیون برابر یا بیشتر خواهد شد.

 

از زمان اختراع PCR، دو پیشرفت تکنیکی عمده به طور قابل توجهی روند PCR را اصلاح کرده است. اولین پیشرفت، بکارگیری و ترویج پلیمرازهای مقاوم به حرارت همانند Taq پلیمراز بوده است که این آنزیم توانایی مقاومت در برابر مرحله تغییر ماهیت یا تقلیب یعنی حدود 94 درجه سانتیگراد را دارد. این بدان معنی است که در حال حاضر می توان بدون افزودن آنزیم پلیمراز تازه بعد از هر مرحله تغییر ماهیت (تقلیب) به لوله های PCR، آزمایش PCR را انجام داد. دومین پیشرفت عمده، توسعهء تجارتی بلوک های حرارتی قابل برنامه ریزی می باشد که این بلوک ها به ترمال سایکلرها (Thermal cycler) معروف هستند. استفاده از ترمال سایکلر در انجام PCR باعث حذف مرحلهء خسته کننده و وقت گیر انتقال لوله‌های PCR از یک بن ماری به بن ماری دیگر می شود ، زیرا این دستگاه که قبلاً بوسیله خود آزمایش کننده تنظیم و برنامه ریزی شده است به طور اتوماتیک حرارتهای لازم را برای مراحل سه گانه PCR تولید می نماید ضمن اینکه تعداد چرخه های مورد نیاز نیز برای انجام PCR و ازدیاد DNA بطور اتوماتیک در این دستگاه بوقوع می پیوندد.

 

با دو پیشرفت فوق الذکر اکنون ما می توانیم تمامی اجزاء PCR را که عبارتند از بافر PCR، دو نوع پرایمر، چهار نوع داُکسی نوکلئوتید تری فسفات dCTP , dTTP , dATP) و (dGTP، آنزیم Taq پلیمراز و DNA الگو (که با روش های مختلف قابل استخراج می باشد)، با همدیگر در لوله های پلی پروپیلن مخلوط کرده  و پس از افزودن یک قطره روغن معدنی بر سطح مخلوط ها، بدون حضور شخص آزمایش کننده لوله های PCR را به مدت چند ساعت در ترمال سایکلر برنامه ریزی شده از قبل قرار داد تا PCR انجام شود. واکنش های تکمیل شده بر روی ژل آگارز برده شده و سپس محصولات PCR یا به عبارت دیگر DNAهای ازدیاد یافته در روی ترانسیلومیناتور ماوراء بنفش 302 نانومتر قابل رویت می شوند.

 

در سالهای اخیر در زمینه اپیدمیولوژی و تشخیص میکروارگانیسم ها تغییراتی در PCR داده شده است. از جمله این تغییرات، تکثیر RNA 16S بجای DNA باکتری است. 16S RNA یکی از انواع RNA ریبوزومی است. این روش نسبت به تکثیر DNA میکروارگانیسم دارای برتری هایی است که عبارتند از:

 

1- واکنش ایزوترمال است یعنی در یک دما انجام می‌گیرد. بدین ترتیب نیازی به استفاده از دستگاه ترمال سایکلر نیست.

 

2- از آنجائیکه هر باکتری دارای بیش از 2000 کپی RNA ریبوزومی است، حساسیت PCR افزایش می یابد. بنابراین به جای یک DNA در میکروارگانیسم، هزاران هدف در یک باکتری وجود دارد.

 

3- محصولات PCR پایدار نیستند. در نتیجه خطر آلودگی به مراتب پائین است.

در تحقیقات اپیدمیولوژیک، شناسایی دقیق سوش عامل بیماری با روش های مختلفی از جمله روش ریبوتایپینگ (Ribotyping) (که در آن RNA ریبوزوم تکثیر می یابد) یا با تعیین الگوی انگشت نگاری DNA انجام می گیرد.

pcranimatie

انتشار توسط 8 تم

درباره‌ی genetical

این سایت جهت بالا بردن سطح علم در جامعه ایران می باشد و برای راحتی و گرد هم آوردن مطالب علمی و پزشکی در یک مکان مجازی که شامل آزمایشگاه ها ، دانلود کتاب ، کنکور , مطالب علمی ژنتیک - بیوشیمی - میکروبیولوژی می باشد . و با به روز رسانی هر روز این سایت مفتخریم که برترین سایت پزشکی ایران شویم .

جوابی بنویسید

ایمیل شما نشر نخواهد شدخانه های ضروری نشانه گذاری شده است. *

*


4 + = نُه

شما می‌توانید از این دستورات HTML استفاده کنید: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>